紫外可見分光光度計(jì)的工作原理是具有限制性條件，分光光度計(jì)的工作原理是物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收和瑯伯-比爾定律。我們這里討論瑯伯-比爾定律的限制性條件。

通過(guò)溶液的光必須是平行的;通過(guò)溶液的光必須是單色光;待測(cè)溶液必須是純凈的、均勻的且濃度不宜過(guò)高，這是瑯伯-比爾定律首要的三個(gè)前提條件。但是在實(shí)際的紫外可見分光光度計(jì)的制造和使用過(guò)程中這三個(gè)條件是不可能達(dá)到的。因?yàn)楣馐侵本€傳播的，在分光光度計(jì)制造過(guò)程中，燈源發(fā)出的光是發(fā)散的，經(jīng)過(guò)聚焦鏡進(jìn)行聚焦等直到經(jīng)過(guò)溶液的整體過(guò)程中，光是不可能平行的。

燈源發(fā)出的光是復(fù)合光，經(jīng)過(guò)狹縫，再經(jīng)過(guò)光柵分光等步驟，因?yàn)槭艿姜M縫和光柵本身的限制，光柵分光不可能達(dá)到純單色光。還有光度計(jì)的整體設(shè)計(jì)問題，光度計(jì)不可能沒有其它的雜光存在。用戶的溶液也不可能是純凈的，也會(huì)含有一些雜質(zhì)，這些對(duì)光度的吸收都會(huì)存在影響。

除以上三個(gè)方面的影響外，在實(shí)際的光度計(jì)應(yīng)用過(guò)程中還會(huì)存在其他因素的影響，例如：經(jīng)過(guò)比色皿的光是否垂直;比色皿寬度是否為10mm的標(biāo)準(zhǔn)值;測(cè)試波長(zhǎng)是否準(zhǔn)確;程序設(shè)計(jì)是否存在漏洞等等，都會(huì)直接影響到利用瑯伯-比爾定律計(jì)算出的結(jié)果。所以在日常的測(cè)試過(guò)程中，得出的結(jié)果和瑯伯-比爾定律有些偏差是很正常的，只是我們關(guān)注偏差多少的問題。